2629

 

 

روش شمارش ميكرو ارگانيسم‏هاي (سرماگرا و سرمادوست)

 

 

 

چاپ دوم


موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران

موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران تنها سازماني است در ايران كه بر طبق قانون ميتواند استاندارد رسمي فرآورده‏ها را تعيين و تدوين و اجراي آنها را با كسب موافقت شورايعالي استاندارد اجباري اعلام نمايد. وظايف و هدفهاي موسسه عبارتست از:

( تعيين، تدوين و نشر استانداردهاي ملي – انجام تحقيقات بمنظور تدوين استاندارد بالا بردن كيفيت كالاهاي داخلي، كمك به بهبود روشهاي توليد و افزايش كارائي صنايع در جهت خودكفائي كشور- ترويج استانداردهاي ملي – نظارت بر اجراي استانداردهاي اجباري – كنترل كيفي كالاهاي صادراتي مشمول استاندارد اجباري و جلوگيري از صدور كالاهاي نامرغوب به منظور فراهم نمودن امكانات رقابت با كالاهاي مشابه خارجي و حفظ بازارهاي بين المللي كنترل كيفي كالاهاي وارداتي مشمول استاندارد اجباري به منظور حمايت از مصرف كنندگان و توليدكنندگان داخلي و جلوگيري از ورود كالاهاي نامرغوب خارجي راهنمائي علمي و فني توليدكنندگان، توزيع كنندگان و مصرف كنندگان – مطالعه و تحقيق درباره روشهاي توليد، نگهداري، بسته بندي و ترابري كالاهاي مختلف – ترويج سيستم متريك و كاليبراسيون وسايل سنجش – آزمايش و تطبيق نمونه كالاها با استانداردهاي مربوط، اعلام مشخصات و اظهارنظر مقايسه‏اي و صدور گواهينامه‏هاي لازم ) .

موسسه استاندارد از اعضاء سازمان بين المللي استاندارد مي باشد و لذا در اجراي وظايف خود هم از آخرين پيشرفتهاي علمي و فني و صنعتي جهان استفاده مي نمايد و هم شرايط كلي و نيازمنديهاي خاص كشور را مورد توجه قرار مي دهد.

اجراي استانداردهاي ملي ايران به نفع تمام مردم و اقتصاد كشور است و باعث افزايش صادرات و فروش داخلي و تأمين ايمني و بهداشت مصرف كنندگان و صرفه جوئي در وقت و هزينه ها و در نتيجه موجب افزايش درآمد ملي و رفاه عمومي و كاهش قيمتها مي شود.

 


 

تهيه كننده

كميسيون استاندارد ميكروبيولوژي مواد غذايي

 

رئيس

رئيس آزمايشگاه بيمارستان تهران

دكتراي علوم آزمايشگاهي

روحبخشي خالقدوست - عباس

 

اعضاء

آزمايشگاه موادغذائي موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران

دكترا در صنايع غذائي

شهيدي - گونش

آزمايشگاه ميكروبشناسي موادغذائي آزمايشگاه كنترل غذا و دارو - وزارت بهداري

دكتر دامپزشك

صدرزاده – پرويز

آزمايشگاه كنترل موادغذائي ارتش جمهوري اسلامي ايران

دكتر دامپزشك

ميرحسيني - حسين

 

دبير

كارشناس موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران

فوق ليسانس بيولوژي

حق شناس - فريده


فهرست مطالب

 

روش شمارش ميكروارگانيسم‏هاي سرمادوست و سرماگرا

هدف و دامنه كاربرد

تعريف

اساس آزمايش

روش آزمايش

گزارش آزمون


 

بسمه تعالي

پيشگفتار

 استاندارد روش شمارش ميكروارگانيسم‏هاي ( سرماگرا و سرمادوست ) كه بوسيله كميسيون فني ميكروبيولوژي موادغذائي تهيه و تدوين شده و در پنجاه و دومين كميته ملي استاندارد فرآورده‏هاي كشاورزي و غذائي مورخ 65/3/6 مورد تائيد قرار گرفته , اينك باستناد ماده يك قانون موادالحاقي به قانون تاسيس موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران مصوب آذرماه 1349 بعنوان استاندارد رسمي ايران منتشر ميگردد .

 براي حفظ همگامي و همآهنگي با پيشرفتهاي ملي و جهاني در زمينه صنايع و علوم , استانداردهاي ايران در مواقع لزوم مورد تجديدنظر قرار خواهند گرفت و هرگونه پيشنهادي كه براي اصلاح يا تكميل اين استانداردها برسد در هنگام تجديدنظر در كميسيون فني مربوط مورد توجه واقع خواهد شد .

 بنابراين براي مراجعه به استانداردهاي ايران بايد همواره از آخرين چاپ و تجديدنظر آنها استفاده نمود .

 در تهيه و تدوين اين استاندارد سعي شده است كه ضمن توجه بشرايط موجود و نيازهاي جامعه حتي‏المقدور بين اين استاندارد كشورهاي صنعتي و پيشرفته همآهنگي ايجاد شود .

 لذا با بررسي امكانات و مهارتهاي موجود و اجراي آزمايشهاي لازم اين استاندارد با استفاده از منابع زير تهيه گرديده است :

1-   ISO Draft Proposal ISO / DP 8552 – 1984
Milk Enumeration of psychrotrophic micro organisms
Colony count technique At 21 C.

2-   ISO Draft Proposal ISO / DP 6730 – 1983
Milk Enumeration of psychrotrotrophic Micro organisms
colony count techniaue at 65 C

3-   International Dairy Federation (IDF) Standard 101 – 1981
Liquid milk enumeration of psychrotrophic Micro - organisms
colony count technique at 65 C

4-   International commission on microbiological specifications
for foods (ICMSF) 1980 /
Microbial ecology of foods Academic press

5-   Marvin L – Speak editor (1976)
Compendium of methods for the microbiological
examination of foods prepared by the apha in tersociety /
Agency committee on microbiological methods for foods

6-   Professor D.A.A. Mossel FAPHA unicf – Geneva (1973)
Recommended routin monitoring procedures for the microbiological
examination of foods and drinking water

 



  روش شمارش ميكروارگانيسم‏هاي سرمادوست1 و سرماگرا2

  1- هدف و دامنه كاربرد

 هدف از تدوين اين استاندارد , ارائه روش مرجع جهت شمارش ميكروارگانيسم‏هاي سرما دوست و سرماگرا است . كه در دماي يخچال (8-2) و حرارتهاي تا 21 درجه سلسيوس قادر به رشد و تكثير ميباشند .

  2- تعريف

 2-1- باكتريهاي سرمادوست

 ميكروارگانيسم هائي هستند كه درجه حرارت مناسب رشد آنها 15 درجه يا كمتر و حداكثر 20 درجه و يا كمتر و حداقل صفر يا كمتر ميباشد .

 2-2- باكتريهاي سرماگرا

 ميكروارگانيسم‏هائي هستند كه درجه حرارت مناسب رشد آنها 30-25 درجه سانتي‏گراد و حداكثر 35-30 درجه و حداقل 5+ درجه يا كمتر مي‏باشد .

 بسياري از سويه‏هاي باكتريهاي مزوفيل ميتوانند در دماي يخچالي رشد نمايند . بنابراين باكتريهائي مانند اشري شيا3 – كلبسيلا4 - سراشيا5 پروتئوس6 - ستيروباكتر7 - كلستريديوم8 - پزودوموناس9 و تعدادي ديگر جزو باكتريهاي سرماگرا محسوب مي‏شوند .

 هم چنين تعدادي از قارچ‏ها نيز مانند ژئوتريكوم10 و بوتريتيس11 نيز در حرارت‏هاي پائين رشد مي‏نمايند .

  3- اساس آزمايش

 با توجه به نوع ماده غذائي و روش نگهداري آن درجه حرارت مناسب ( درجه حرارت يخچالي و يا 21 درجه ) هم چنين محيط كشت مناسب براي شمارش ميكروارگانيسم انتخاب مي‏شود .

 3-1- روش شمارش باكتريهاي سرمادوست : نمونه مورد آزمون و يا رقت‏هاي اعشاري تهيه شده از آن بروش سطحي كشت داده ميشوند , سپس مدت 10 روز در دماي يخچال نگهداري شده و پس از آن پرگنه‏هاي ظاهر شده شمارش ميشوند .

 3-2- روش شمارش باكتريهاي سرماگرا : نمونه مورد آزمون و يا رقت‏هاي اعشاري تهيه شده از آن بروش سطحي كشت داده مي‏شوند و براي 24 ساعت در 21±0/5 درجه سلسيوس نگهداري شده و پس از آن پرگنه‏هاي ظاهر شده شمارش مي‏شوند .

  4- روش آزمايش

 4-1- وسايل لازم :

 وسايل معمول در آزمايشگاه ميكروبشناسي است .

 4-2- محلول‏ها و محيطهاي لازم

 كليه محلول‏هاي رقيق كننده و محيطهاي كشت بايد در حرارت يخچال نگهداري شوند .

 4-2-1- محلول رينگر (s solution ' Ringer)

 4-2-1-1- تركيب

 4-2-1-2- طرز تهيه

 مواد فوق را در آب مقطر حل كرده , پس از تقسيم به حجم‏هاي مورد نظر در 121 درجه سلسيوس بمدت 15 دقيقه آنرا سترون كنيد . pH نهائي پس از سترون كردن بايد 7 باشد . سپس تا موقع مصرف در يخچال و جاي خنك نگهداري كنيد . اين محلول تا يك هفته پس از تهيه قابل استفاده است .

 براي تهيه محلول رينگر  يك قسمت از محلول رينگر تهيه شده طبق بند (4-2-1-2) را با سه قسمت آب مقطر مخلوط كرده , سپس در حجم‏هاي مساوي تقسيم كنيد و در اتوكلاو بمدت 10 دقيقه و در 121 درجه سلسيوس سترون كنيد .

 قرص‏هاي محلول رينگر بصورت تجارتي در دسترس است در صورت استفاده از آنها طبق دستور مربوطه عمل شود .

 4-2-2- محيط كشت كينگ (king Medium)

 4-2-2-1- تركيب محيط :

 

4-2-2-2- طرز تهيه :

 مواد فوق را با يكديگر مخلوط كرده , بملايمت حرارت دهيد تا حل شوند . سپس بمدت يك الي دو دقيقه بآرامي آنرا بجوشانيد . pH محيط را طوري تنظيم كنيد كه پس از سترون كردن 7±0/1 درجه باشد سپس آنرا بمدت 20 دقيقه در 121 درجه سلسيوس سترون نمائيد . محيط را تا 60-50 درجه سلسيوس خنك كره , سپس با رعايت شرايط ستروني در حجم‏هاي 20-150 ميلي‏ليتري , در ظروف پتري تقسيم كرده و در يخچال نگهداريد .

 4-2-3- محيط كشت كانت آگار ( شمارش پرگنه )

 Standard Plate count Method

4 2-3- 1- تركيب محيط

 4-2-3-2- طرز تهيه :

 مواد فوق را به يك ليتر آب مقطر افزوده و حرارت دهيد تا بجوش آيد بمنظور حل شدن كامل و يكنواخت شدن آنرا هم بزنيد سپس در 121 درجه سانتي گراد بمدت 15 دقيقه سترون كنيد . pH نهائي محلول بعد از سترون كردن بايد 7±0/2 درجه باشد .

 يادآوري - چنانچه از محيط تجارتي استفاده ميشود بايد طبق دستور مربوطه عمل شود .

 4-3- آماده كردن نمونه و تهيه رقت‏هاي لازم :

 نمونه مورد آزمون را برطبق بند 3 استاندارد روش آماده كردن نمونه‏هاي غذائي براي شمارش آماده كرده و برطبق بند 4 همان استاندارد رقت‏هاي لازم از آن را تهيه كنيد . ( مراجعه به استاندارد شماره 356 ايران )

 4-4- دستور كار

 ظروف پتري آماده محتوي محيط كشت‏هاي بند (4-2-2) و يا (4-2-3) را كه در يخچال قرار دارد و به تعداد موردنياز با شماره تاريخ كشت و رقت نمونه علامتگذاري كنيد . ( براي هر رقت دو ظرف پتري انتخاب كنيد ).

 يادآوري - در همه موارد براي شمارش اين باكتري‏ها از روش كشت سطحي استفاده ميشود و پورپليت بكار نمي‏رود .

 كشت دادن را از رقيق‏ترين محلول غذائي آماده شده شروع كرده و از هر رقت 0/1 ميلي‏ليتر توسط پي پت سترون به ظروف پتري محتوي محيطهاي بند 4-2-2 و يا 4-2-3 افزوده و توسط پخش كننده12 سترون شيشه‏اي در سطح آنها بگسترانيد .

 در ظروف پتري را بسته و آنها را مدت 15 دقيقه بحال خود بگذاريد تا سطح آنها كمي خشك شود . سپس ظروف پتري محتوي محيط كينك بند (4-2-2) را مدت 24 ساعت بطور واژگون در دماي 21±0/5 درجه سانتيگراد قرار داده , هم چنين ظروف پتري محتوي محيط پليت كانت آگار بند (4-2-3) را نيز مدت 10-7 روز در يخچال بگذاريد . پس از انقضاي مدتهاي لازم , ظروف را خارج نموده و مورد بررسي قرار دهيد .

 ظروفي كه تعداد پرگنه‏هاي ظاهر شده در آنها 30 الي 300 پرگنه است براي شمارش انتخاب كنيد .

 - پرگنه‏هائي كه در محيط كشت اندكي خزيده‏اند يك كليني تك بحساب آوريد . اگر پرگنه‏هائي كه در يك چهارم ظرف بنحوي رشد كرده‏اند كه بعلت تداخل قابل شمارش نيستند بايد پرگنه‏هاي ظاهر شده روي سه چهارم ديگر ظرف پتري را شمرده و تعداد كل را با درنظر گرفتن تمام ظرف پتري گزارش كنيد .

 چنانچه بيش از  ظرف پوشيده از پرگنه است , آن ظرف را كنار بگذاريد .

 4-5- شمارش

 ظروف پتري را كه داراي 30 الي 300 پرگنه هستند , جهت شمارش انتخاب كرده و سپس تعداد ميكروارگانيسم‏ها را در هر گرم از نمونه غذائي مورد آزمايش با توجه به رقت بكار رفته حساب كنيد .

 4-5-1- چنانچه رقم سوم عدد شمارش شده به 5 ختم ميشد آنرا برطبق دو بند زير سر راست كنيد .

 4-5-1-1- اگر عدد شمارش شده سه رقمي و مجموع دو رقم اول آن از سمت چپ عدد زوج و رقم سوم آن 5 عدد به عدد كمتر يعني صفر سر راست كنيد .

 مثلا 225 را 220 و 245 را 240 گزارش كنيد .

 4-5-1-2- اگر عدد شمارش شده سه رقمي و مجموع دو رقم سمت چپ آن عدد فر دو رقم سوم 5 بود , آنرا به عدد بالاتر سر راست كنيد .

 مثلا 235 را 240 و 225 را 260 گزارش كنيد .

 4-5-2- چنانچه رقم سوم عدد شمارش شده به كمتر از 5 ختم ميشد آنرا به عدد كوچكتر سر راست كنيد .

 مثلا 234 را 230 گزارش كنيد .

 4-5-3- چنانچه اختلاف نتايج بين دو آزمايش انجام شده روي يك نمونه توسط يك آزمايش كننده بيش از 30 درصد باشد . آزمايش كننده بايد در روش بكار برده شده مجددا بررسي نمايد .

  5- گزارش آزمون

 گزارش آزمون بايد شامل جزئيات زير باشد .

 5-1- روش بكار رفته براي آزمون و نتيجه حاصل از آزمايش

 5-2- شرايطي كه در اين استاندارد قيد نشده و در آزمايش بكار رفته است .

 5-3- اطلاعات كامل راجع به نمونه مورد آزمون

 

 

 

 

 

1-Psychrophilic bacteria

2-Psychrotrephic

3-Escherichia

4-Klebsiella

5-Serratia

6-Proteous

7-Citrobacter

8-Clostridium

9-Pseudomonas

10-Geotricum

11-Botrytis

12-پخش كننده عبارتست از ميله شيشه‏اي ( بهم زن شيشه‏اي ) كه سر آن تحت زاويه 90 درجه بمقدار 3 سانتيمتر خم شده است .


 

ISLAMIC REPUBLIC OF IRAN

 

Institute of Standards and Industrial Research of Iran

 

ISIRI NUMBER

 

2629

 

 

Enumeration of psychropjilie and psychrotrophic

Micro – organisms in food istedition

 

 

 

2nd Edition