4925

 

 

شير،شير خشك . روش جستجو واندازه گيري آفلاتوكسين M1

 

 

 

 


آشنايي با موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران

موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران به موجب قانون، تنها مرجع رسمي كشور است كه عهده دار وظيفه تعيين، تدوين و نشر استانداردهاي ملي(رسمي) مي‏باشد.

تدوين استاندارد در رشته‏هاي مختلف توسط كميسيون‏هاي فني مركب از كارشناسان موسسه ، صاحبنظران مراكز و موسسات علمي، پژوهشي، توليدي و اقتصادي آگاه و مرتبط با موضوع صورت مي‏گيرد. سعي بر اين است كه استانداردهاي ملي، درجهت مطلوبيت‏ها و مصالح ملي و با توجه به شرايط توليدي، فني و فن آوري حاصل از مشاركت آگاهانه و منصفانه صاحبان حق و نفع شامل:

توليد كنندگان، مصرف كنندگان، بازرگانان، مراكز علمي و تخصصي و نهادها و سازمان‏هاي دولتي باشد. پيش نويس استانداردهاي ملي جهت نظرخواهي براي مراجع ذينفع و اعضاي كميسيون‏هاي فني مربوط ارسال مي‏شود. و پس از دريافت نظرات و پيشنهادها در كميته ملي مرتبط با آن رشته طرح و درصورت تصويب به عنوان استاندارد ملي(رسمي) چاپ و منتشر مي‏شود.

پيش‏نويس استانداردهايي كه توسط موسسات و سازمان‏هاي علاقمند و ذيصلاح و با رعايت ضوابط تعيين شده تهيه مي‏شود نيز پس از طرح و بررسي در كميته ملي مربوط و درصورت تصويب، به عنوان استاندارد ملي چاپ و منتشر مي‏گردد. بدين ترتيب استاندارهايي ملي تلقي مي‏شود كه بر اساس مفاد مندرج در استاندارد ملي شماره «5» تدوين و در كميته ملي مربوط كه توسط موسسه تشكيل مي‏گردد به تصويب رسيده باشد.

موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران از اعضاء اصلي سازمان بين‏المللي استاندارد مي‏باشد كه در تدوين استانداردهاي ملي ضمن توجه به شرايط كلي و نيازمندي‏هاي خاص كشور، از آخرين پيشرفت‏هاي علمي، فني و صنعتي جهان و استانداردهاي بين‏المللي استفاده مي‏نمايد.

موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران مي‏تواند با رعايت موازين پيش‏بيني شده در قانون به منظور حمايت از مصرف كنندگان، حفظ سلامت و ايمني فردي و عمومي، حصول اطمينان از كيفيت محصولات و ملاحظات زيست محيطي و اقتصادي، اجراي بعضي از استانداردها را با تصويب شوراي عالي استاندارد اجباري نمايد. موسسه مي‏تواند به منظور حفظ بازارهاي بين‏المللي براي محصولات كشور، اجراي استاندارد كالاهاي صادراتي و درجه بندي آن را اجباري نمايد.

همچنين به منظور اطمينان بخشيدن به استفاده كنندگان از خدمات سازمان‏ها و موسسات فعال در ضمينه مشاوره، آموزش، بازرسي، مميزي و گواهي كنندگان سيستم‏هاي مديريت كيفيت و مديريت زيست محيطي، آزمايشگاه‏ها و كاليبره كنندگان وسايل سنجش، موسسه استاندارد اينگونه سازمان‏ها و موسسات را بر اساس ضوابط نظام تائيد صلاحيت ايران مورد ارزيابي قرار داده و در صورت احراز شرايط لازم، گواهي نامه تائيد صلاحيت به آنها اعطا نموده و بر عملكرد آنها نظارت مي‏نمايد. ترويج سيستم بين‏المللي يكاها، كاليبراسيون وسايل سنجش، تعيين عيار فلزات گرانبها و انجام تحقيقات كاربردي براي ارتقاي سطح استانداردهاي ملي از ديگر وظائف اين موسسه مي‏باشد.

 


 

كميسيون استاندارد

شير،شير خشك - روش جستجو واندازه گيري آفلاتوكسين M1

 

رئيس

دانشگاه تهران - دانشكده دامپزشكي

دكتراي بهداشت و صنايع شير

كريم -گيتي

 

اعضاء

آزمايشگاه شبكه دامپزشكي تهران

ليسانس علوم دامي

ابريشمي زاده –محمدعلي

آزمايشگاه كنترل غذا و دارو وزارت بهداشت ، درمان و آموزش پزشكي

ليسانس علوم تغذيه

پرويز -محمد

كارخانجات شير پاستوريزه تهران

دكتراي دامپزشكي

دبيريان- شهريار

آزمايشگاه مركز تشخيص سازمان دامپزشكي

دكتراي دامپزشكي

ضيايي- حسن

دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي دانشكده داروسازي

دكتراي داروسازي

يزدان پناه- حسن

 

دبير

اداره كل استاندارد و تحقيقات صنعتي استان تهران

فوق ليسانس علوم بهداشتي در تغذيه

پوراعتدال- زهره


فهرست مطالب

 

شير و شير خشك - روش جستجو و اندازه  گيري آفلاتوكسينM1

هدف و دامنه كاربرد

تعاريف و اصطلاحات

اساس روش

مواد شيميايي مورد نياز

وسايل

نمونه  برداري

نحوه عمل

تفسير نتايج

پيوست : راهنماي آماده سازي محلول استاندارد آفلاتوكسين M1

آماده سازي محلول  ها

تعيين غلظت آفلاتوكسين

تعيين خلوص كروماتوگرافي

نگهداري محلول  هاي استاندارد


 

بسمه تعالي

پيشگفتار

استاندارد شير و شيرخشك - روش جستجو و اندازه  گيري آفلاتوكسين1  Mكه بوسيله كميسيون فني مربوطه تهيه و تدوين شده و در سيزدهمين كميته ملي استاندارد ميكروبيولوژي مورخ 1377/12/5 مورد تأييد قرار گرفته  ، اينك باستناد بند  1ماده  3قانون اصلاحي قوانين و مقررات مؤسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران مصوب بهمن ماه سال  1371بعنوان استاندارد رسمي ايران منتشر ميگردد.

براي حفظ همگامي و هماهنگي با پيشرفتهاي ملي و جهاني در زمينه صنايع و علوم  ، استانداردهاي ايران در مواقع لزوم مورد تجديدنظر قرار خواهند گرفت و هرگونه پيشنهادي كه براي اصلاح يا تكميل اين استانداردها برسد در هنگام تجديدنظر در كميسيون فني مربوط مورد توجه واقع خواهد شد.

بنابراين براي مراجعه به استانداردهاي ايران بايد همواره از آخرين چاپ و تجديدنظر آنها استفاده نمود.

در تهيه و تدوين اين استاندارد سعي شده است كه ضمن توجه به شرايط موجود و نيازهاي جامعه حتي  المقدور بين اين استاندارد و استاندارد كشورهاي صنعتي و پيشرفته هماهنگي ايجاد شود.

لذا با بررسي امكانات و مهارتهاي موجود و اجراي آزمايشهاي لازم اين استاندارد با استفاده از منابع زير تهيه گرديده است :

1- International Provisional IDF Standard 111A : 1990

.2- AOAC Official Methods of Analysis 1995

 

1- با توجه به تجربيات آزمايشگاهي انجام شده در اداره كل آزمايشگاههاي كنترل غذا و دارو

شير و شير خشك - روش جستجو و اندازه  گيري آفلاتوكسين M1

1- هدف و دامنه كاربرد

هدف از تدوين اين استاندارد تعيين روش جستجو و اندازه  گيري آفلاتوكسين M1 درشير و شيرخشك مي  باشد.

اين استاندارد براي شير كامل  ، شير نيم  چرب (شامل شيرهايي كه به آنها شيرخشك بدون چربي اضافه شده است ) و شير بدون چربي به صورت خام  ، پاستوريزه شده  ،  1UHT يااستريليزه كاربرد دارد. براي اين فرآورده  ها حدود تعيين آفلاتوكسين 0/015 M1 ميكروگرم در ليتر است و براي شيرخشك كامل  ، شيرخشك بدون چربي حدود تعيين  0/15ميكروگرم به ازاء هر كيلوگرم است .

هشدار : كار با اين تركيبات با توجه به امكان خطر سرطان  زائي آنها بايد با دقت و با رعايت شرايط ايمني انجام گيرد.

2- تعاريف و اصطلاحات

در اين استاندارد واژه  ها و اصطلاحات با مفاهيم زير كاربرد دارد:

2-1- آفلاتوكسين : آفلاتوكسين ماده سمي است كه در طي رشد كپك  هاي آسپرژيلوس فلاووس 2  و آسپرژيلوس پارازيتيكوس 3 بر روي بادام زميني  ، دانه غلات  ، آرد و ساير غذاها و همچنين خوراك دام ايجاد مي  شود.

2-2- آفلاتوكسين  : M 1آفلاتوكسين1  Mمتابوليت هيدروكسيله آفلاتوكسينB1است و ميزان ترشح آفلاتوكسين M 1در شير دام به ميزان آفلاتوكسين1  Bدريافتي دام از راه خوراك بستگي دارد.

3- اساس روش

3-1- استخراج آفلاتوكسين  M1از آزمونه با استفاده از كلروفرم  ، تخليص عصاره به دست آمده توسط ستون كروماتوگرافي و تبخير عصاره خالص شده به اندازه حجم مشخص كه بتوان در كروماتوگرافي لايه نازك دوبعدي از آن استفاده كرد.

3-2- در روش كروماتوگرافي لايه نازك  ، تخمين چشمي ميزان آفلاتوكسين )M1يا اندازه  گيري توسط فلورودانستيومتر) از طريق مقايسه شدت فلورسنس آفلاتوكسين M1نمونه با محلول استاندارد آفلاتوكسين با غلظت مشخص صورت مي  گيرد و سپس لكه حاصل با استفاده از تري فلورواستيك اسيد و مقايسه خواص كروماتوگرافي آن تأييد مي  شود.

4- مواد شيميايي مورد نياز

مواد شيميايي بايد داراي كيفيت آزمايشگاهي باشند. آب مورد استفاده بايد آب مقطر يا حداقل با خلوص مشابه باشد.

4-1- كلروفرم  ، پايدار شده با 1- 0/5درصد اتانول  %96(حجم به حجم )                                                   Chloroform

4-2- تولوئن Toluene                                                  

4-3- اسيداستيك گلاسيال (%  99/7<)    Acetic acid , glacial

4-4- استونيتريل                                          Acetonitrile

4-5- دي اتيل اتر عاري از پراكسايد كه اتانول آن كمتر از  0/05درصد (حجم به حجم ) باشد.   Diethyl ether                        4-6- ا ِ ن – هگزان           n - Hexane

4-7- استن Acetone                                                   

4-8- متانول                                                  Methanol

4-9- سديم كلرايد                                Sodium chloride

4-10- سديم دودسيل سولفات          Sodium dodecylsulfate

4-11- تري فلورواستيك اسيد                Trifluoroacetic acid

4-12- محلول اشباع سديم كلرايد كه بايد براي تهيه آن از يك روز قبل مقدار  400گرم سديم كلرايد با يك ليتر آب مخلوط شود.

4-13- محلول  50گرم در ليتر سديم دودسيل سولفات

 

Sodium dodecylsulsfate solution

 

 5گرم سديم دودسيل سولفات را در  100ميلي  ليتر آب حل كنيد.

4-14- مخلوط تولوئن و اسيد استيك گلاسيال به نسبت  9 + 1(حجم به حجم ).

4-15- مخلوط استونيتريل + دي اتيل اتر + ا ِ ن هگزان به نسبت  10+30+60(حجم به حجم ).

4-16- مخلوط كلروفرم و استن به نسبت  4+1(حجم به حجم ).

4-17- مخلوط دي اتيل اتر + متانول + آب به نسبت  94+4/5+1/5(حجم به حجم ).

4-18- مخلوط كلروفرم + استن + متانول به نسبت  87+10+3(حجم به حجم ).

4-19- مخلوط حلال  ها براي ظهور روي صفحه  هاي لايه نازك .

الف ) هنگام استفاده از صفحه  هاي آماده 4 نسبت اختلاط كلروفرم + متانول + اسيد استيك  90+10+2(حجم به حجم ) است .

ب ) هنگام استفاده از صفحه  هاي  Macherey - Nagelنسبت اختلاط كلروفرم + متانول + اسيد استيك + آب به ميزان  92+8+1+0/8(حجم به حجم ) است . در صورت ضرورت مقدار متانول را تغيير دهيد «به يادآوري (يك ) بند 7-4- 2مراجعه كنيد».

4-20- مخلوط تري فلورو استيك اسيد + ا ِ ن - هگزان به نسبت  1+4(حجم به حجم ) اين مخلوط را به صورت تازه تهيه كنيد. (فقط به مدت چند روز آن را نگهداري نمود(.

4-21- پشم شيشه                                Glass wool wadding

4-22- سولفات سديم بدون آب با دانه  زبر    Sodium sulfate

4-23- سليكاژل  60(MERCK) براي كروماتوگرافي ستوني با اندازه ذرات 200- 63ميكرومتر. سليكاژل را به مدت يك ساعت در دماي  105درجه سلسيوس (بند 5-20) در يك ظرف چيني 5 (بند 5-18) (با ضخامت ديواره حدود  0/5سانتيمتر) خشك كنيد. سپس سليكاژل را به يك ارلن مخلوطي (بند 5-14) منتقل كنيد و در ارلن را ببنديد. پس از سرد كردن به ازاي هر  100گرم يك ميلي  ليتر آب اضافه كنيد و مجددا درب ارلن را ببنديد. به مدت يك دقيقه تكان دهيد و حداقل  15ساعت به منظور ته  نشين شدن آن را به حال خود قرار دهيد.

4-24- گاز خنثي (به عنوان مثال گاز نيتروژن )

4-25- صفحات لايه نازك از سليكاژل به ابعاد  20*20سانتيمتر براي مثال سليكاژل MERCK 60 (روي شيشه ) يا معادل آن . در صورتي كه از صفحات لايه نازك غير از شيشه استفاده مي  شود آنها را به ابعاد  10*10سانتيمتر ببريد. ميزان  Rfآفلاتوكسين M1در ماده صاف شده (بند 4-17) بايد 0/3- 0/2سانتيمتر باشد.

4-26- محلول استاندارد آفلاتوكسين M1با غلطت  10ميكروگرم در ميلي  ليتر در كلروفرم .

يادآوري  1- محلول استاندارد آفلاتوكسين M1درون آمپول سربسته به طور تجارتي در دسترس مي  باشد.

يادآوري  2- استاندارد آفلاتوكسين M1به صورت ليوفيليزه 6 درون ويال نيز موجود است كه طبق دستورالعمل سازنده تهيه مي  شود.

4-26-1محلول ذخيره افلاتوكسين  M1حاوي يك ميكروگرم در ميلي ليتر.

هنگام استفاده از آمپول (يادآوري بند 4-26) به طور كمي محتوي ان  را به يك بالن حجمي با حجم 25 ميلي ليتر (بند 5-10) منتقل كنيد و آمپول را با كلروفرم (بند 4-1) شستشو دهيد ومواد حاصل  از شستشو را به محتوي  بالن  حجمي منتقل نمائيد.محتوي  بالن را تا غلظت نشانه توسط كلروفرم رقيق كنيد.اين محلول حاوي يك ميكروگرم در ميلي ليتر آفلاتوكسين M1است .ارلن حاوي محلول بايد به خوبي در بندي شده و دركاغذ آلومينيم  براي  جلوگيري از نفوذ نور پيچيده شود.در زمانيكه از محلول استفاده نمي شود آن را در تاريكي و در دماي پائين از  5درجه سلسيوس نگهداري كنيد.

4-26-2- محلول هاي آفلاتوكسين 7M1مورد استفاده براي آزمايش

قبل از آماده سازي رقت هاي مورد استفاده آفلاتوكسين ضروري است كه محلول ذخيره (بند 4-26-1)كه قبلا در دماي كمتر از  5درجه سلسيوس نگهداري شده بود،در دماي  20درجه سلسيوس قرار گيرد وسپس براي تهيه رقت هاي مورد نظر از آن برداشت شود.

4-26-2 --1محلول مورد استفاده براي كروماتوگرافي لايه نازك

به وسيله پي پت مقدار 0/5ميلي ليتر آفلاتوكسين M1با غلظت يك ميكروگرم در ميلي  ليتر (محلول ذخيره ) را به لوله مخروطي مدرج  10ميلي  ليتري (بند 5-16) منتقل نمائيد و با كلروفرم تا خط نشانه 10 ميلي  ليتر رقيق كنيد. اين محلول حاوي  0/05ميكروگرم در ميلي  ليتر آفلاتوكسين M1مي  باشد. محلول را در لوله  هاي كاملا دربسته و در تاريكي نگهداري كنيد. زمان نگهداري از  14روز تجاوز نكند. چنانچه محلول باقيمانده در لوله كمتر از  2ميلي  ليتر باشد محلول جديدي تهيه نمائيد.

5- وسايل

5-1- تبخيركننده چرخشي مجهز به خلاء 8

5-2- قيف جداكننده با درب پلي تترافلورواتيلن (PTFE) با ظرفيت  250ميلي  ليتر.

5-3- ستون شيشه  اي براي كروماتوگرافي ستوني با طول  30سانتيمتر و قطر داخلي يك سانتيمتر و مخزني تقريبأ به حجم  15ميلي  ليتر كه انتهاي پاييني آن باريك شده و دايره كوچكي را با قطر  4ميلي  متر تشكيل مي  دهد كه مجهز به شير مناسب است به «شكل (1) مراجعه كنيد».

5-4- ميكروسرنگ با ظرفيت  50و  100ميكروليتر.

5-5- مخلوط كن چرخشي 9

5-6- وسايل معمولي آزمايشگاهي براي كروماتوگرافي لايه نازك .

5-7- لامپ فرابنفش قابل تنظيم با طول موج  360نانومتر. شدت نور لامپ فرابنفش بايد به گونه  اي باشد كه بعد از كروماتوگرافي از فاصله  10سانتيمتري لكه  اي با غلظت  0/1نانوگرم آفلاتوكسين M1به وضوح مشاهده گردد.

يادآوري : در هنگام استفاده از لامپ  هاي فلورسنت لازم است از فيلتري بين لامپ و صفحه استفاده گردد كه نور فرابنفش را عبور داده و نور مرئي را جذب نمايد. همچنين توصيه شده است كه صفحه از طريق فيلتر بي  رنگي كه جاذب نور فرابنفش است مورد آزمون قرار گيرد. وجود صافي اختلاف رنگ بين لكه و زمينه را افزايش مي  دهد و قابليت مشاهده لكه  هاي آبي فلورسنت را بالا مي  برد. اين صافي بايد بين چشم و صفحه (و نه بين لامپ و صفحه ) قرار گيرد.

5-8- بشرهاي شيشه  اي با ظرفيت  25و  250ميلي  ليتر.

5-9- استوانه  اي مدرج با ظرفيت  هاي 25، 50، 100،  250ميلي ليتر.

5-10- بالن حجمي با ظرفيت  25ميلي  ليتر.

5-11- پي  پت مدرج با ظرفيت  5ميلي  ليتر (براي آماده  سازي مقادير كم مايع ).

-12-5قيف شيشه اي با قطر 7سانتيمتر

5-13- كاغذ صافي با قطر  15سانتيمتر.10

5-14- ارلن مخروطي با گلو و در سمباده  اي همراه با درپوش و با ظرفيت  200ميلي  ليتر.

5-15- بالن ته گرد با ظرفيت  150ميلي  ليتر.

5-16- لوله  هاي شيشه  اي با گلو و در سمباده  اي با ظرفيت  4و  10ميلي  ليتر.

5-17- وسايل مناسب براي تبخير كلروفرم در لوله  هاي مخروطي (5-16) در جريان گاز ازت و دماي بالا (تقريبأ 50- 40درجه سلسيوس ).

5-18- بشقاب چيني صاف با قطر تقريبي  20سانتيمتر.

5-19- لوله  هاي شيشه  اي مويين با نگهدارنده و ظرفيت تقريبي  5ميكروليتر.

5-20- گرمخانه قابل تنظيم در دماي 105- 75درجه سلسيوس .

6- نمونه  برداري

به استاندارد ملي ايران به شماره  326تحت عنوان «نمونه  برداري از شير و فرآورده  هاي شير» مراجعه كنيد.

7- نحوه عمل

بهتر است كار دور از نور مستقيم انجام شود.

7-1- استخراج

7-1-1- شير مايع

شير مايع  ، محلول سديم كلرايد (بند 4-12) و كلروفرم (بند 4-1) را تا حدود  4درجه سانتيگراد سرد كنيد. مقدار  50ميلي  ليتر شير را به قيف جداكننده (بند 5-2) منتقل كنيد.  10ميلي  ليتر محلول سديم كلرايد را اضافه كنيد و به منظور مخلوط نمودن محتوي قيف به آرامي آن را بچرخانيد. همانند بند 7-1-3 ادامه دهيد.

7-1-2- شير خشك

مقدار  5گرم شيرخشك را با تقريب  0/1گرم در يك بشر  250ميلي  ليتري توزين نمائيد.  50ميلي  ليتر آب با دماي  50درجه سانتيگراد را كم  كم به شيرخشك اضافه كنيد. با استفاده از يك ميله همزن تا زمان بدست آوردن مخلوط همگن آن را مخلوط كنيد و در آب باقيمانده بهم بزنيد. محلول شيرخشك را به مدت  30دقيقه (در دماي حدودا  4درجه سانتيگراد) نگهداريد و سپس آن را با قيف جداكننده (بند 5-2) منتقل كنيد. سپس  10ميلي ليتر محلول سديم كلرايد (سرد شده تا دماي  4درجه سانتيگراد) (بند 4-12) اضافه كنيد . بشر را با مقداري محلول سديم كلرايد سرد شده شستشو داده و محلول حاصل را به قيف جداكننده منتقل نمائيد. سپس در دماي اطاق مقدار  10ميلي  ليتر محلول سديم دودسيل سولفات (بند 4-13) را اضافه نمائيد. محتواي موجود در قيف جداكننده را به آرامي مخلوط كنيد و همانند بند 7-1- 3ادامه دهيد.

7-1-3- مقدار  125ميلي  ليتر كلروفرم (سرد شده تقريبا تا دماي  4درجه سانتيگراد) اضافه كنيد. به طور مكرر به مدت يك دقيقه قيف جداكننده را چرخانده و وارونه كنيد به طوريكه دو فاز آبي و كلروفرم كاملا مخلوط شده و در ضمن از تشكيل امولسيون جلوگيري گردد و بگذاريد تا لايه  ها از يكديگر جدا شوند.

يادآوري  1- اگر لايه  ها جدا نمي  شوند براي شكستن امولسيون مخلوط را سانتريفوژ كنيد.

يادآوري  2- جهت آزمون  هاي روزمره استخراج شير يا شير بازسازي شده مي  توان از متيلن كلرايد به جاي كلروفرم استفاده كرد. در صورتيكه اهداف ويژه  اي براي آزمايش مورد نظر باشد يا شبه و ترديدي در آزمون مشاهده مي  گردد بايد از كلروفرم استفاده نمود.

7-1-4- لايه كلروفرمي (لايه پاييني ) را به داخل يك ارلن مخروطي منتقل كنيد (بند 5-14) و تقريبأ  5گرم سولفات سديم بدون آب (4-22) به آن اضافه نمائيد و به مدت  15دقيقه مخلوط كنيد، آن را ثابت نگه داريد و گاهي آن را تكان دهيد. به وسيله كاغذ صافي (5-13) آن را صاف كنيد و  75ميلي  ليتر از محلول صاف شده را در يك استوانه مدرج (بند 5-9) جمع  آوري نمائيد.

يادآوري : چنانچه ماده صاف شده بدست آمده كمتر از  75ميلي  ليتر باشد در فرمول محاسبه (بند 8) بايد در نظر گرفته شود.

7-2- كروماتوگرافي ستوني

7-2-1- ستون سليكاژل را به صورت زير تهيه كنيد: در ته ستون شيشه  اي (بند 5-3) مقدار كمي پشم شيشه قرار دهيد و ستون را با  10ميلي  ليتر كلروفرم (بند 4-1) پركنيد و حباب  هاي هوا را خارج نمائيد. يك گرم سولفات سديم اضافه كرده  ، ديواره داخل ستون را تقريبأ با يك ميلي  ليتر كلروفرم شستشو دهيد تا ذرات سولفات سديم چسبيده به آن حذف شوند و مطمئن شويد كه سطح لايه سولفات سديم افقي است .

مقدار دو گرم سليكاژل (بند 4-23) را وزن نمائيد و فورا (در حالت خشك ) آن را به ستون منتقل كنيد، مقدار پنج ميلي  ليتر كلروفرم (بند 4-1) اضافه كنيد و مخلوط را تا زمانيكه سليكاژل به طور كامل در كلروفرم پخش شود و تمام هوا از آن خارج گردد بهم بزنيد. مقداري از كلروفرم را خارج كنيد تا زمانيكه سطح آن به سه سانتيمتر بالاتر از لايه سليكاژل برسد. وقتي كه سليكاژل ته  نشين گرديد آن را تقريبأ با دو گرم سولفات سديم (بند 4-22) بپوشانيد. كلروفرم را تا بالاي سطح لايه سولفات سديم خارج كنيد.

يادآوري : در زمان آماده  سازي ستون اين امر مهم است كه كلروفرم بيش از حد تعيين شده استفاده نشود زيرا كلروفرم اضافي موجب غيرفعال شدن ستون سليكا مي  شود و دليل آن وجود اتانول پايداركننده در كلروفرم است .

7-2-2- عصاره بدست آمده در بند 7-1- 4را به ستون منتقل كنيد و تحت تأثير نيروي ثقل تا زمانيكه سطح مايع به سطح بالايي لايه سولفات سديم برسد آن را عبور دهيد. بگذاريد ستون خشك شود.

7-2-3- ستون را با  25ميلي  ليتر مخلوط تولوئن + اسيد استيك گلاسيال (4-14) شستشو دهيد تا جائيكه سطح مايع به سطح بالايي لايه سولفات سديم برسد. محلول شستشو را خارج كنيد.

7-2-4- ستون را با  25ميلي  ليتر ا ِ ن - هگزان (بند 4-6) شستشو دهيد تا سطح مايع به سطح بالايي لايه سولفات سديم برسد و سپس مايع شستشو را خارج كنيد.

7-2-5- ستون را با  25ميلي  ليتر مخلوط استونيتريل + دي اتيل اتر + ا ِ ن - هگزان (بند 4-15) شستشو دهيد تا جايي كه سطح مايع به سطح بالايي لايه سولفات سديم برسد. مايع شستشو را خارج كنيد.

7-2-6- سرانجام آفلاتوكسين M1باقيمانده در ستون را با  60ميلي  ليتر مخلوط كلروفرم + استن (بند 4-16) عبور دهيد و مايع شستشو را در يك بالن ته  گرد (بند 5-15) جمع  آوري كنيد و تا زمان خشك شدن توسط تبخيركننده چرخشي (بند 5-1) آن را تبخير نمائيد. به طور كمي باقيمانده را با استفاده از كلروفرم (بند 4-1) به لوله  اي با حجم چهار ميلي  ليتر (بند 5-16) منتقل كنيد.

يادآوري : مراحل 7-2- 2تا 7-2- 6بدون وقفه بايد ادامه يابد و در هيچيك از مراحل ستون كروماتوگرافي نبايد خشك شود.

7-2-7- محلول را در دماي حدود  50درجه سلسيوس در جريان گاز خنثي (4-24) تبخير كنيد. از حرارت دادن زياد عصاره خشك خودداري نمائيد. وقتي لوله سرد شد با استفاده از سرنگ (بند 5-4) مقدار 100 ميكروليتر كلروفرم (بند 4-1) را به آن اضافه كنيد و به وسيله مخلوط كن (بند 5-5) محتوي لوله را به مدت يك دقيقه مخلوط نمائيد.

7-3- كروماتوگرافي لايه نازك

7-3-1- آماده  سازي صفحه لايه نازك براي اندازه  گيري چشمي

7-3-1-1- خطوط را بر روي صفحه لايه نازك (بند 4-25) مطابق شكل «2» نشانه  گذاري نمائيد. با استفاده از ميكروسرنگ (بند 5-4) محلول  هاي زير را در محل  هاي  Eو  D، C،  B ، Aمانند شكل  2لكه  گذاري نمائيد.

 :Aمقدار  20ميكروليتر از عصاره نمونه كامل در بند 7-2-.7

 :Dمقدار سه ميكروليتر محلول كار آفلاتوكسين M1 (با غلظت  0/05ميكروگرم در ميلي  ليتر) مطابق بند (4-26-2).

 :Eمقدار شش ميكروليتر محلول كار آفلاتوكسين M1 (با غلظت  0/05ميكروگرم در ميلي  ليتر) مطابق بند (4-26-2-1).

 :Bمقدار  12ميكروليتر محلول كار آفلاتوكسين M1 (با غلظت  0/05ميكروگرم در ميلي  ليتر) مطابق بند (4-26-2-1).

 :Cمقدار  24ميكروليتر محلول كار آفلاتوكسين M1 (با غلظت  0/05ميكروگرم در ميلي  ليتر) مطابق بند (4-26-2-1).

7-3-1-2- صفحه را از جهت فاز متحرك اول (شكل 2) در يك تانك كروماتوگرافي كه تا عمق يك سانتيمتري با مخلوط دي اتيل اتر + متانول و آب (بند 4-17) پر شده است گذارده و تانك را در تاريكي قرار دهيد. زمانيكه مخلوط حلال به فاصله خط  2سانتيمتري از لبه بالاي صفحه لايه نازك رسيد، صفحه را از تانك خارج كرده و حداقل به مدت  5دقيقه در معرض هوا آن را خشك كنيد. صفحه را  90درجه چرخانده و آن را در جهت فاز متحرك دوم در مخلوط حلال كلروفرم + استن + متانول (بند 4-18) به طريق شرح داده شده در بالا قرار دهيد (شكل 3) و سپس صفحه را به مدت  15دقيقه در معرض هوا و تاريكي خشك كنيد.

يادآوري : به منظور حصول اطمينان از ظهور يكسان لكه  ها توصيه مي  شود كه دو صفحه در حاليكه از جهت لايه نازك روبروي هم قرار گرفته  اند به طور همزمان در يك تانك گذاشته شوند. بهتر است كه روي صفحه  ها با صفحه شيشه  اي پوشانده شوند و پس از ظهور در جهت فاز متحرك دوم و خشك شدن  ، از نور خورشيد محافظت شوند.

7-3-2- بررسي چشمي صفحه كروماتوگرافي لايه نازك و تخمين مقدار آفلاتوكسين M1

7-3-2-1- صفحه كروماتوگرافي لايه نازك را پس از ظهور دو بعدي تاثير نور فرابنفش با طول موج تقريبأ  360نانومتر به فاصله  10سانتي  متر از منبع نور (بند 5-7) آزمايش كنيد.لكه  هاي آفلاتوكسين M1داراي نور فلورسنس آبي مي  باشند.

در صورت ضرورت با استفاده از يك برس نرم يا دميدن ذرات غبار فلورسنت دار را از مجاورت مستقيم لكه  هاي آفلاتوكسينM1دور كنيد. محل لكه  هاي ´ Dتا´ Eاستاندارد آفلاتوكسين M1را مشخص كنيد (شكل 3). آفلاتوكسين M1  موجود در عصاره بر روي خط فرضي كه استانداردهاي  ´ Dتا  E´  را وصل مي  كند قرار مي  گيرد. شدت فلورسنس آبي استانداردها و نمونه را مقايسه كنيد. اگر شدت فلورسنت لكه آفلاتوكسين M1نمونه از سري استانداردها قويتر باشد عصاره (نمونه ) را پنج بار رقيق كنيد. به اين ترتيب كه نمونه را تبخير نمائيد تا خشك شود و سپس با كسر حجم اوليه مورد استفاده در كروماتوگرافي آن را پنج مرتبه رقيق كنيد. كروماتوگرافي لايه نازك را با استفاده از عصاره رقيق شده تكرار نمائيد.

7- 3- 2- 2- چنانچه در مورد وجود آفلاتوكسين M1ترديدي باشد، مجددا عصاره را با استاندارد آفلاتوكسين M1به عنوان استاندارد داخلي 11 كروماتوگرافي دو بعدي كنيد تا لكه ناشناخته به عنوان آفلاتوكسين M1تاييد شود.

7- 4- تاييد شناسايي آفلاتوكسين M1

7- 4- 1- آماده سازي صفحه پس از اندازه  گيري چشمي (7-3-2).

7- 4- 1- 1- صفحات ظاهر شده دو بعدي را زير نور فرابنفش قرار دهيد (بند 5-7) با دقت به وسيله مداد مركز آنچه را كه عصاره نمونه به عنوان آفلاتوكسين M1فرض شده است (شكل  3نقطه A) و همچنين مركز له استاندارد آماده M1 (شكل  4نقطه B) را نشانه  گذاري كنيد. با استفاده از يك لوله مويين (بند5-19) تقريبا  5ميكروليتر مخلوط تري فلورواستيك اسيد + ا ِ ن - هگزان (بند 4-20) به هر دو نقطه  Aو  Bاضافه كنيد.

7- 4- 1- 2- نقاطي را كه به آنها مخلوط تري فلورواستيك اسيد + ا ِ ن - هگزان اضافه شده است با يك صفحه شيشه  اي و گرم بپوشانيد. «گرمخانه (بند 5-20) در دماي  75درجه سلسيوس استفاده كنيد» و صفحه لايه نازك را در دماي  75درجه سلسيوس به مدت  5دقيقه قرار دهيد. صفحه را از گرمخانه خارج كنيد و آن را به مدت يك دقيقه در يك سطح صاف سرد نمائيد. صفحه را در جهت فاز متحرك اول در مخلوط كلروفرم + متانول + اسيد استيك (بند 4- 19- الف ) يا مخلوط كلروفرم + متانول + اسيد استيك + آب (بند 4-19- ب ) در يك تانك غير اشباع از حلال قرار دهيد. بگذاريد كه حلال به خط مشخص برسد. صفحه را به مدت  10دقيقه در محل تاريكي بگذاريد تا خشك شود و زير نور فرابنفش (بند 5-7) آن را آزمايش كنيد.

صفحه  هاي ظاهر شده را زير نور فرابنفش آزمايش كنيد و  5ميكروليتر مخلوط تري فلورواستيك اسيد + ا ِ ن هگزان (بند 4-20) روي نقاط ´ Aو ´ Bقرار دهيد مطابق توضيح بند 7- 4صفحه را گرم كنيد.

7- 4- 2- بررسي كروماتوگرام (شكل 4)

الف ) ببينيد كه آيا فلورسنت آبي و حاصل از استاندارد ´ Bقابل رويت است يا خير؟ معمولا لكه از قابل رويت  تر است . چنانچه فقط يك لكه مرئي باشد ضروري است نشان دهيم كه اين لكه است (يادآوري 2).

ب ) اگر شرايط (بند الف ) قانع كننده است مشاهده كنيد كه آيا واكنش و احتمالا مرئي است يا خير ؟

ببينيد كه آيا جابه  جايي لكه  هاي -  و  - با جابه جايي لكه  هاي  - و  - مطابقت دارند؟ اگر چنين باشد وجود آفلاتوكسين M1در نمونه اصلي مورد تائيد قرار مي  گيرد.

يادآوري 1- جابه جايي واكنش (- )بايد تقريبا  0/8-1/0سانتي  متر باشد. اگر جابه جايي كمتر از اين مقدار باشد ميزان متانول را در حلال فاز متحرك (بند 4-19) افزايش دهيد تا اين نياز تامين شود.

يادآوري  2- چنانچه پس از استفاده از تري فلورواستيك اسيد با استاندارد فقط يك نقطه مشهود است  ، معلوم نيست كه باشد به ويژه چنانچه لكه ديده نشود. ممكن است هيچ واكنشي صورت نگيرد يا به عنوان نتيجه از ويژگيهاي كروماتوگرافي صفحه  اي (لايه نازك ) جابه جايي لكه  از آنچه در شكل  4نشان داده شده است كمتر باشد.

روش كار زير براي بررسي خصوصيات صفحه لايه نازك و كارايي واكنش به كار مي  رود :

معادل يك نانوگرم محلول استاندارد آفلاتوكسين M1در محل  Aبر روي صفحه لايه نازك 10*10 سانتي متر (شكل 5) قرار دهيد. صفحه را در محلول دي اتيل اتر + متانول و آب ظاهر كنيد (بند 17 -4).

صفحه  هاي ظاهر شده را زير نور فرابنفش آزمايش كنيد و  5ميكروليتر مخلوط تري فلورو استيك اسيد +  nهگزان روي نقاط و قرا دهيد. مطابق توضيح بند 7- 4- 1- صفحه را گرم كنيد.

پس از سرد شدن يك نانو گرم محلول استاندارد آفلاتوكسين M1درنقطه در همان Rfنقطهقرار دهيد و سپس فورا صفحه را در مخلوط كلروفرم + متانول + اسيد استيك ( 5-  19الف ) قرار داده و بگذاريد حلال به ميزان  7سانتي  متر حركت كند. صفحه را به مدت  10دقيقه در تاريكي خشك كنيد. و زير نور فرابنفش مشاهده كنيد كه آيا لكه  ها قابل رويت مي  باشند؟

 : در لكه واكنش باتري فلورواستيك اسيد كامل صورت گرفته و فلورسانس نسبتا شديد وجود دارد.

 :  در لكه واكنش باتري فلورواستيك اسيد صورت نگرفته و فلورسانس در مقايسه با نسبتا ضعيف است .

: لكه  اي از آفلاتوكسين M1است كه در حضور تري فلورواستيك اسيد ظاهر شده است و همان  Rfآفلاتوكسين M1را ايجاد مي  كند.

در جابجايي فاصله   - نبايد از 3- 2سانتي  متر كمتر باشد. در غير اينصورت آزمون را با افزايش متانول (5-19) تكرار نمائيد. لكه  هاي و بايد داراي  Rfيكسان باشند. بايد بين و قابل رويت باشد در غير اينصورت نحوه كار را كه شامل معرف  ها و مواد شيميايي  ، دما و روش افزودن تري فلورواستيك اسيد مي  باشد كنترل كنيد. اگر لكه به مقدار كافي تشكيل شود،ممكن است قابل مشاهده نباشد و شايد دليل آن عدم كفايت شدت اشعه فرابنفش باشد. لامپ را از نظر تامين نيازمنديهاي بند 5- 7مورد بررسي قرار دهيد.

8- تفسير نتايج

 8- 1- كروماتوگرافي لايه نازك - اندازه  گيري چشمي

ميزان آفلاتوكسين M1نمونه شير مايع بر حسب ميكروگرم در ليتر به ترتيب زير محاسبه مي  شود.

ميزان آفلاتوكسين M1نمونه شير خشك بر حسب ميكروگرم در كيلو گرم به ترتيب زير محاسبه مي  شود:

  = Vst  حجم استاندارد آفلاتوكسين M1بر حسب ميكروليتر.

  = Vm  حجم عصاره نمونه بر حسب ميكروليتر.

 Cst =  غلظت استاندارد آفلاتوكسين M1بر حسب ميكروگرم در ميلي ليتر.

   = V ext حجمي كه عصاره نمونه در آن حل شده است (بر حسب ميكروليتر).

 = Vحجم شير مايع بر حسب ميلي  ليتر.

 = Mوزن شير خشك بر حسب گرم .

= V f  حجم ماده صاف شده به دست آمده (در بند 7-1-4) بر حسب ميلي  ليتر.

 125حجم كلروفرم مورد استفاده در استخراج بر حسب ميلي لير (بند 7-1-3).

بايد روش آزمون به دقت پيگيري شود. ميزان آفلاتوكسين M1شير مايع بر حسب ميكروگرم در ليتر به صورت زير محاسبه مي  شود.

به طور مشابه براي شير خشك ميزان آفلاتوكسين1  Mبر حسب ميكروگرم در كيلوگرم به صورت زير محاسبه مي  شود :

پيوست : راهنماي آماده سازي محلول استاندارد آفلاتوكسين M1

«روش كروماتوگرافي لايه نازك »

1- آماده سازي محلول  ها

1-1- استانداردهاي خشك آفلاتوكسين

براي تهيه استاندارد آفلاتوكسين1  Mبه ظرف محتوي آن به نسبت 1+ 9مخلوط بنزن + استونيتريل اضافه كنيد. از اطلاعات برچسب به عنوان راهنما استفاده نمائيد. (استانداردهاي مورد نظر را با استفاده از مخلوط بنزن و استونيتريل به همان نسبت فوق تهيه نموده و براي كروماتوگرافي لايه نازك نگهداري نمائيد). محلول 0استاندارد تهيه شده را به مدت يك دقيقه روي تكان دهنده 12 تكان دهيد و بدون شستشو به ارلن با درب شيشه  اي مناسب منتقل كنيد. براي توزين يا ساير اهداف آفلاتوكسين خشك را منتقل نكنيد مگر اينكه تسهيلات لازم موجود باشد تا از انتشار آفلاتوكسين به اطراف به دليل شارژ الكتروستاتيك روي ذرات جلوگيري شود.

1-2- استانداردهاي محلول آفلاتوكسين

محلول را به ارلن درب دار شيشه  اي با اندازه مناسب منتقل كنيد. در صورت ضرورت براي به دست آوردن غلظت بين 10- 8ميكروگرم در ميلي ليتر آن را رقيق كنيد.

2- تعيين غلظت آفلاتوكسين

طيف فرابنفش محلول آفلاتوكسين را بين طول موج 370- 330نانومتر در برابر حلال به كار رفته براي محلول در سل مرجع 13 ثبت كنيد. غلظت محلول آفلاتوكسين را با سنجش A در طول ماكزيمم جذب نزديك به  350نانومتر تعيين كنيد و تساوي زير را به كار ببريد :

/(A×MW×1000×CF)=آفلاتوكسين M1ميكروگرم در هر ميلي ليتر

 = CFضريب تصحيح

با جايگزيني در فرمول زير  CFرا محاسبه كنيد.

/CF=3160

در حاليكه  3160ارزش  براي محلول دي كرومات پتاسيم است .

اگر  1/05   CF>يا  0/95   CF<باشد، روش يا ابزار را براي تعيين علت يا حذف آن مورد بررسي قرار دهيد.

 = MW(وزن مولكولي ) و  مطابق جدول (1) مي  باشد.

محلول آفلاتوكسين را به ارلن درب دار شيشه  اي اصلي منتقل كنيد (قرار گرفتن به طور طبيعي در معرض نور فرابنفش در طي سنجش  Aموجب عدم تبديل به فرآورده نوري قابل مشاهده مي  شود).

3- تعيين خلوص كروماتوگرافي

جهت تعيين خلوص كروماتوگرافي استاندارد تهيه شده مطابق روش كروماتوگرافي لايه نازك شرح داده شده در متن استاندارد عمل شود.

4- نگهداري محلول  هاي استاندارد

در هر بار استفاده يك ميلي  ليتر از هر استاندارد را در ارلن حجمي با درب شيشه  اي آماده كنيد. اين محلول كار را به يك ويال كوچك منتقل كنيد. براي اطمينان قبل از نگهداري پس از اينكه مقدار لازم از محلول استاندارد براي رقيق شدظ يا لكه  گذاري برداشته شوند ارلن  هاي حاوي محلول  هاي استاندارد را با دقت (mg) وزن كنيد و براي مراتب بعدي وزن را يادداشت كنيد.

وسايل را محكم در فويل آلومينيم بپيچيد و در صفر درجه سلسيوس نگهداري كنيد. چنانچه محلول پس از نگهداري مجددا مورد استفاده قرار گيرد ارلن را وزن كنيد و هر تغيير را ثبت كنيد. جهت اجتناب از تركيب آب با ماده جمع آوري شده  ، قبل از استفاده تمام استانداردها را به دماي اطاق برسانيد. قبل از رسيدن دماي محتواي ارلن به دماي اطاق فويل آلومينيوم را خارج نكنيد.

هر بار در موقع رقيق و لكه گذاري مجددا خلوص آن را تعيين كنيد.

 

 

 

1-Ultra high temperature

 

2-Aspergillus flavus

 

3-Aspergillus parasiticus

 

-4ساخت كارخانه  MERK

 

5-Porcelain dish

 

6-Lyophilized

 

7-Working Standard

 

8-Rotary vaccum evaporator.

 

9-Vortex mixer

 

-10نوع 595 Schleicher and SchÜll يا معادل آن مناسب  است .

 

11-Internal Standard

 

12-Vortex shaker

 

13-Reference cell


 

ISLAMIC REPUBLIC OF IRAN

 

Institute of Standards and Industrial Research of Iran

 

ISIRI NUMBER

 

4925

 

 

Milk and Dried milk - determination of Aflatoxin M1 Content