5234

 

 

شير و فرآورده‏هاي آن – شمارش اشريشيا كلي – روش بيشترين تعداد احتمالي (MPN)

 

 

 

 


آشنايي با موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران

موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران به موجب قانون، تنها مرجع رسمي كشور است كه عهده دار وظيفه تعيين، تدوين و نشر استانداردهاي ملي(رسمي) مي‏باشد.

تدوين استاندارد در رشته‏هاي مختلف توسط كميسيون‏هاي فني مركب از كارشناسان موسسه ، صاحبنظران مراكز و موسسات علمي، پژوهشي، توليدي و اقتصادي آگاه و مرتبط با موضوع صورت مي‏گيرد. سعي بر اين است كه استانداردهاي ملي، درجهت مطلوبيت‏ها و مصالح ملي و با توجه به شرايط توليدي، فني و فن آوري حاصل از مشاركت آگاهانه و منصفانه صاحبان حق و نفع شامل:

توليد كنندگان، مصرف كنندگان، بازرگانان، مراكز علمي و تخصصي و نهادها و سازمان‏هاي دولتي باشد. پيش نويس استانداردهاي ملي جهت نظرخواهي براي مراجع ذينفع و اعضاي كميسيون‏هاي فني مربوط ارسال مي‏شود. و پس از دريافت نظرات و پيشنهادها در كميته ملي مرتبط با آن رشته طرح و درصورت تصويب به عنوان استاندارد ملي(رسمي) چاپ و منتشر مي‏شود.

پيش‏نويس استانداردهايي كه توسط موسسات و سازمان‏هاي علاقمند و ذيصلاح و با رعايت ضوابط تعيين شده تهيه مي‏شود نيز پس از طرح و بررسي در كميته ملي مربوط و درصورت تصويب، به عنوان استاندارد ملي چاپ و منتشر مي‏گردد. بدين ترتيب استاندارهايي ملي تلقي مي‏شود كه بر اساس مفاد مندرج در استاندارد ملي شماره «5» تدوين و در كميته ملي مربوط كه توسط موسسه تشكيل مي‏گردد به تصويب رسيده باشد.

موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران از اعضاء اصلي سازمان بين‏المللي استاندارد مي‏باشد كه در تدوين استانداردهاي ملي ضمن توجه به شرايط كلي و نيازمندي‏هاي خاص كشور، از آخرين پيشرفت‏هاي علمي، فني و صنعتي جهان و استانداردهاي بين‏المللي استفاده مي‏نمايد.

موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران مي‏تواند با رعايت موازين پيش‏بيني شده در قانون به منظور حمايت از مصرف كنندگان، حفظ سلامت و ايمني فردي و عمومي، حصول اطمينان از كيفيت محصولات و ملاحظات زيست محيطي و اقتصادي، اجراي بعضي از استانداردها را با تصويب شوراي عالي استاندارد اجباري نمايد. موسسه مي‏تواند به منظور حفظ بازارهاي بين‏المللي براي محصولات كشور، اجراي استاندارد كالاهاي صادراتي و درجه بندي آن را اجباري نمايد.

همچنين به منظور اطمينان بخشيدن به استفاده كنندگان از خدمات سازمان‏ها و موسسات فعال در ضمينه مشاوره، آموزش، بازرسي، مميزي و گواهي كنندگان سيستم‏هاي مديريت كيفيت و مديريت زيست محيطي، آزمايشگاه‏ها و كاليبره كنندگان وسايل سنجش، موسسه استاندارد اينگونه سازمان‏ها و موسسات را بر اساس ضوابط نظام تائيد صلاحيت ايران مورد ارزيابي قرار داده و در صورت احراز شرايط لازم، گواهي نامه تائيد صلاحيت به آنها اعطا نموده و بر عملكرد آنها نظارت مي‏نمايد. ترويج سيستم بين‏المللي يكاها، كاليبراسيون وسايل سنجش، تعيين عيار فلزات گرانبها و انجام تحقيقات كاربردي براي ارتقاي سطح استانداردهاي ملي از ديگر وظائف اين موسسه مي‏باشد.

 


 

كميسيون استاندارد شير و فرآورده‏هاي آن – شمارش اشريشياكلي به روش بيشترين

تعداد احتمالي (MPN)

 

رئيس

دانشگاه علوم پزشكي تهران - دانشكده بهداشت

دكتراي تخصصي ميكروب‏شناسي

سلطان دلال - محمد مهدي

 

اعضاء

اداره كل استاندارد و تحقيقات صنعتي استان تهران

ليسانس تغذيه

اطيابي – پوراندخت

دانشگاه تهران - دانشكده دامپزشكي

دكتراي دامپزشكي

اطيابي – ناهيد

اداره كل استاندارد و تحقيقات صنعتي استان تهران

فوق ليسانس علوم بهداشتي در تغذيه

پوراعتدال – زهره

سازمان دامپزشكي كشور

دكتراي دامپزشكي

جفرودي – خديجه

موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران

فوق ليسانس بيولوژي

حق شناس – فريده

كارخانه شير و لبنيات پاستوريزه كاله

دكتراي دامپزشكي

خاتمي مقدم – اسماعيل

كارخانجات شير پاستوريزه تهران

دكتراي دامپزشكي

دبيريان – شهريار

كارخانجات لبنيات پاك

فوق ليسانس قارچ‏شناسي

شكوه زنگنه - محمد حسين

سازمان دامپزشكي كشور

دكتراي دامپزشكي

صابوني – مصطفي

شركت آب و فاضلاب استان تهران

ليسانس بيولوژي

صديقي – هما

دانشگاه الزهرا

فوق ليسانس ميكروبيولوژي

عبدي عالي – احيأ

موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران

كارشناس صنايع

مهرپور – رامش

كارخانه شير و لبنيات پاستوريزه كاله

ليسانس صنايع غذايي

مفتاح نياكي – ماريا

 

دبير

اداره كل استاندارد و تحقيقات صنعتي استان تهران

ليسانس ميكروبيولوژي

صميعي – بيتا


فهرست مطالب

 

شير و فرآورده‏هاي آن - شمارش اشريشياكلي به روش بيشترين تعداد احتمالي

هدف و دامنه كاربرد

اصطلاحات و تعاريف

اساس روش

مواد لازم

وسايل لازم

نمونه‏برداري

طرز تهيه آزمايه

روش كار

انتخاب رقتها

تعيين , محاسبه و بيان نتايج

دقت

گزارش آزمون

پيوست الف

پيوست ب


 

بسمه تعالي

پيشگفتار

 استاندارد شير و فرآورده‏هاي آن - شمارش اشريشياكلي - روش بيشترين تعداد احتمالي (MPN) كه بوسيله كميسيون‏هاي مربوطه تهيه و تدوين شده و در پانزدهمين جلسه كميته ملي استاندارد ميكروبيولوژي مورخ 1378/7/24 مورد تائيد قرار گرفته , اينك باستناد بند 1 ماده 3 قانون اصلاح قوانين و مقررات موسسه استاندارد و تحقيقات صنعتي ايران مصوب بهمن ماه 1371 به عنوان استاندارد ملي ايران منتشر مي‏شود .

 براي حفظ همگامي و هماهنگي با تحولات و پيشرفتهاي ملي و جهاني در زمينه صنايع , علوم و خدمات استانداردهاي ملي ايران در مواقع لزوم تجديدنظر خواهد شد و هر گونه پيشنهادي كه براي اصلاح يا تكميل اين استانداردها ارائه شود در هنگام تجديدنظر در كميسيون فني مربوط مورد توجه قرار خواهد گرفت .

 بنابراين براي مراجعه به استانداردهاي ايران بايد همواره از آخرين تجديدنظر آنها استفاده كرد .

 در تهيه و تدوين اين استاندارد سعي شده است كه ضمن توجه به شرايط موجود و نيازهاي جامعه در حد امكان بين اين استاندارد و استاندارد كشورهاي صنعتي و پيشرفته هماهنگي ايجاد شود .

 منابع و ماخذي كه براي تهيه اين استاندارد به كار رفته به شرح زير است :

1-   ISO 11866 – 1 1997
Milk and milk products – enumeration of presumptive escherichia coli
Part 1: most probable number technique

2-   Greenberg A.E Conners J.J Jenkins D. franson M.A.H
Standard methods for the examination of water and waste water 15th ed
American public health association Washington
DC, P: 882 1

3-   ISO 8261 – milk and milk products = preparation of test samples and dilutions for microbiological examination

 

 

  شير و فرآورده‏هاي آن - شمارش اشريشياكلي 1 به روش بيشترين تعداد احتمالي 2

  1 ـ هدف و دامنه كاربرد

 هدف از تدوين اين استاندارد تعيين روش شمارش اشريشياكلي به روش بيشترين تعداد احتمالي در فرآورده‏هاي زير مي‏باشد :

 - شير و فرآورده‏هاي شيري مايع .

 - شيرخشك , پودر آب پنير شيرين , پودر دوغ كره , لاكتوز .

 - كازئين اسيدي , كازئين لاكتيك , كازئين حاصل از رنين .

 - كازئينات , پودر آب پنير اسيدي .

 - پنير و پنيرهاي فرآيند شده .

 - كره

 - فرآورده‏هاي شيري منجمد ( مانند بستني و فرآورده‏هاي يخي خوراكي )3

- كاستارد , دسر و كرم‏ها .

 يادآوري 1 ـ روش ارائه شده در اين استاندارد ترجيحا براي شمارش اشريشياكلي احتمالي در نمونه‏هايي با مقادير كمتر از 100 باكتري در گرم يا 10 باكتري در ميلي ليتر مي‏باشد .

 يادآوري 2 ـ از آنجا كه بعضي از اشريشياكلي‏هاي بيماري‏زا در دماي 44 درجه سلسيوس رشد نمي‏كنند بنابراين حساسيت اين روش به تغييرپذيري زياد , كاربرد اين استاندارد را تا حد زيادي محدود مي‏نمايد .

 لذا نتايج حاصل از اين روش بايد برطبق اطلاعات موجود در بند 11 اين استاندارد تفسير گردد .

 يادآوري 3 ـ جهت آگاهي از روش جست و جوي اشريشياكلي احتمالي به استاندارد ملي ايران 2946 (( روش جست و جو و شمارش بيشترين تعداد احتمالي اشريشياكلي در مواد غذائي )) مراجعه كنيد .

  2 ـ اصطلاحات و تعاريف

 در اين استاندارد واژه‏ها و اصطلاحات با تعاريف زير به كار برده مي‏شوند :

 2 ـ 1 ـ اشريشياكلي - باكتريهايي هستند كه طبق روش توصيه شده در اين استاندارد در دماي 44 درجه سلسيوس با تخمير لاكتوز ايجاد گاز كرده و از تريپتوفان اندول توليد مي‏كنند .

 2 ـ 2 ـ آزمايه - 4 نمونه‏اي است كه با رعايت ضوابط نمونه‏برداري از نمونه آزمايشگاهي جهت انجام آزمايش‏هاي گوناگون تهيه مي‏شود . بعضي از نمونه‏هاي آزمايشگاهي بدون هيچ تغييري و تنها با مخلوط كردن كامل مي‏توانند به عنوان آزمايه به كار روند .

 2 ـ 3 ـ آزمونه - 5 مقدار معين از نمونه‏اي است كه براي يك آزمايش از آزمايه به طور وزني يا حجمي به دقت برداشته مي‏شود .

  3 ـ اساس روش

 3 ـ 1 ـ كشت سه لوله آزمايش حاوي محيط غني كننده انتخابي مايع با غلظت 2 برابر (4-3-1-1 ـ الف ) با مقدار مشخصي از آزمايه در صورتي كه آزمايه مايع باشد و يا با مقدار مشخصي از رقت اوليه در مورد ساير نمونه‏ها .

 3 ـ 2 ـ كشت سه لوله آزمايش حاوي محيط غني كننده انتخابي مايع با غلظت معمولي -(4-3-1-1 ـ ب ) با مقدار مشخصي از آزمايه در صورتي كه آزمايه مايع باشد و يا با مقدار مشخصي از رقت اوليه در مورد ساير نمونه‏ها .

 سپس تحت همان شرايط , كشت محيط با غلظت معمولي -(4-3-1-1 ـ ب ) با رقت‏هاي دهدهي از آزمايه يا رقت اوليه .

 3 ـ 3 ـ گرمخانه‏گذاري لوله‏هاي با غلظت دو برابر و معمولي در دماي 37 درجه سلسيوس به مدت 24 تا 48 ساعت و بررسي لوله‏ها از نظر توليد گاز .

 3 ـ 4 ـ كشت از لوله‏هاي حاوي محيط با غلظت دو برابر و معمولي كه حاوي گاز هستند در سري جديد لوله‏هاي حاوي دومين محيط انتخابي (4-3-.2)

 3 ـ 5 ـ گرمخانه‏گذاري لوله‏ها در دماي 44 درجه سلسيوس به مدت 24 تا 48 ساعت و بررسي سري جديد لوله‏ها (3-4) از نظر توليد گاز .

 3 ـ 6 ـ كشت از لوله‏هاي حاوي محيط انتخابي مايع (3-5) كه حاوي گاز هستند , در لوله‏هاي محتوي آب تريپتونه .

 3 ـ 7 ـ گرمخانه‏گذاري لوله‏ها در دماي 44 درجه سلسيوس به مدت 24 تا 48 ساعت و سپس بررسي لوله‏ها (3-6) از نظر توليد اندول .

 3 ـ 8 ـ لوله‏هاي كشت داده شده طبق مراحل 3-1 و يا 3-2 كه پس از رشد در دماي 44 درجه سلسيوس در محيط انتخابي مايع طبق مرحله 3-5 مولد گاز بوده و در محيط آب تريپتونه طبق مرحله 3-7 در همين دما اندول توليد كنند , از نظر وجود اشريشياكلي احتمالي مثبت تلقي مي‏شوند .

 3 ـ 9 ـ تعيين شاخص 6 MPN از تعداد لوله‏هاي مثبت ( بند 3-8) در رقتهاي انتخابي به وسيله جدول MPN ( پيوست ) و محاسبه بيشترين تعداد احتمالي اشريشياكلي در گرم يا در ميلي ليتر از نمونه اوليه .

  4 ـ مواد لازم

 4 ـ 1 ـ كليات :

 براي آگاهي از قواعد كلي به استاندارد ملي ايران 2325 آئين كاربرد روش‏هاي عمومي آزمايشهاي ميكروبيولوژي تجديدنظر اول مراجعه شود .

 اگر محيطهاي كشت آماده و معرفها فورا استفاده نشوند , جهت جلوگيري از هر گونه تغيير در تركيبات آنها , بايد دور از نور و در دماي صفر تا پنج درجه سلسيوس و به مدت زمان كمتر از يك ماه نگهداري شوند .

 4 ـ 2 ـ رقيق كننده‏ها :

 4 ـ 2 ـ 1 ـ پپتون نمك‏دار 7

 4 ـ 2 ـ 1 ـ 1 ـ تركيبات :

Pepton

1 گرم

 پپتون

Sodium Chloride

8/5 گرم

 كلريد سديم

Distilled Water

1000 ميلي ليتر

 آب مقطر

 4 ـ 2 ـ 1 ـ 2 ـ طرز تهيه :

 مواد فوق را در آب مقطر حل نموده و در صورت لزوم محلول را حرارت دهيد (PH را پس از سترون نمودن بايد در 7±0/1 تنظيم كرد ).

 4 ـ 2 ـ 2 ـ سيترات سديم ( براي پنير )

 4 ـ 2 ـ 2 ـ 1 ـ تركيبات :

 Trisodium citrate

 20 گرم

 تري سديم سيرات

(Na3C6 H5 O2 , 2H2O)  

 Distilled Water

 1000 ميلي ليتر

 آب مقطر

 4 ـ 2 ـ 2 ـ 2 ـ طرز تهيه : تري سديم سيترات را در آب مقطر حل نمائيد .

 4 ـ 2 ـ 3 ـ دي پتاسيم هيدروژن فسفات ( براي كازئين )

 4 ـ 2 ـ 3 ـ 1 ـ تركيبات :

 phosphate Dipotassium hydrogen

 20 گرم

 دي پتاسيم هيدروژن فسفات (K2 PO4)

 Distilled Water

 1000 ميلي ليتر

 آب مقطر

 4 ـ 2 ـ 3 ـ 2 ـ طرز تهيه :

 دي پتاسيم هيدروژه فسفات را در آب مقطر حل كنيد .

 رقيق كننده‏ها را پس از تهيه به ظروف مناسب منتقل نموده و در دماي 121 درجه سلسيوس به مدت 15 دقيقه در اتوكلاو سترون كنيد . ( معمولا حجم رقيق كننده‏ها بايد پس از سترون كردن 9±0/2 ميلي ليتر و 90±0/2 ميلي ليتر باشد ).

در صورتي كه رقيق كننده‏هاي تهيه شده در شرايطي نگهداري شوند كه آب خود را از دست ندهند , حداكثر تا يك ماه قابل مصرف مي‏باشند .

 يادآوري - آب مورد استفاده براي تهيه رقيق كننده‏ها و محيط كشت بايد آب مقطر يا فاقد يون بوده و عاري از موادي باشد كه تحت شرايط آزمايشگاه از رشد ميكروارگانيزم‏ها جلوگيري نمايد .

 4 ـ 3 ـ محيطهاي كشت :

 4 ـ 3 ـ 1 ـ آبگوشت لوريل سولفات تريپتوز 8 Broth ( محيط غني كننده انتخابي )

 4 ـ 3 ـ 1 ـ 1 ـ تركيبات :

 

 ب

 الف

 

 

 مقدار مواد با غلظت معمولي

 مقدار مواد با غلظت 2 برابر

 

 Trypton

 20 گرم

 40 گرم

 تريپتون

 Lactose

 5 گرم

 10 گرم

 لاكتوز

  Potassium dihydrogen  phosphate

 2/75 گرم

 5/5 گرم

 دي پتاسيم هيدروژن فسفات(K2 HPO4)

 Potassium dihydrogen  phosphate

 2/75 گرم

 5/5 گرم

 پتاسيم دي هيدروژن فسفات  (K2 HPO4)

 Sodium chloride

  5 گرم

 10 گرم

 كلريد سديم 

 Sodium lauryl sulfate

  0/1 گرم

 0/2 گرم

 سديم لوريل سولفات

 Distilled Water

 1000 ميلي ليتر

 

 آب مقطر

 4 ـ 3 ـ 1 ـ 2 ـ طرز تهيه :

 تركيبات فوق را در آب مقطر حل نموده و ( در صورت لزوم حرارت دهيد ) PH را به گونه‏اي تنظيم كنيد كه پس از سترون كردن معادل 6/8 در دماي 25 درجه سلسيوس باشد . محيطهاي كشت با غلظت معمولي و غلظت 2 برابر را در حجم‏هاي 10 ميلي ليتر به ترتيب در لوله‏هايي به ابعاد 160*16 و 200*20 ميلي متر و داراي لوله‏هاي دورهام تقسيم كرده و سپس لوله‏ها را در اتوكلاو قرار داده و در دماي 121 درجه سلسيوس به مدت 15 دقيقه سترون كنيد . پس از سترون كردن لوله‏هاي دورهام بايد فاقد حباب‏هاي هوا باشند .

 4 ـ 3 ـ 2 ـ آب گوشت C.E ( دومين محيط انتخابي )

 4 ـ 3 ـ 2 ـ 1 ـ تركيبات :

 Tryptose or Trypticase

 20 گرم

 تريپتوز يا تريپتيكاز

 Lactose

 5 گرم

 لاكتوز

 Bile salts

 1/5 گرم

 املاح صفراوي 

 Potassium dihydrogen phosphate

 4 گرم

 دي پتاسيم هيدروژن فسفات

(K2 Hpo4)

 Potassium dihydrogen phosphate

 1/5 گرم

 پتاسيم دي هيدروژن فسفات

(KH2 PO4)

 Sodium chloride

 5 گرم

 كلريد سديم

 Distilled Water

 1000 ميلي ليتر

 آب مقطر

 4 ـ 3 ـ 2 ـ 2 ـ طرز تهيه :

 تركيبات فوق را در آب مقطر حل نموده و ( در صورت لزوم حرارت دهيد ) PH را به گونه‏اي تنظيم كنيد كه پس از سترون كردن معادل 7/3 در دماي 20 درجه سلسيوس باشد . محيط در به حجم‏هاي 5 تا 10 ميلي ليتر در لوله‏هايي به ابعاد 160*16 ميلي متر تقسيم كرده به مدت 15 دقيقه درحرارت 121 درجه سلسيوس  سترون كنيد . پس از سترون كردن لوله‏هاي دورهام بايد فاقد حباب‏هاي هوا باشند .

 4 ـ 4 ـ آب تريپتونه :

 4 ـ 4 ـ 1 ـ تركيبات :

 Tryptone

 10 گرم

 تريپتون  

 Sodium chloride

 5 گرم

 كلريد سديم

 Distilled Water

 1000 ميلي ليتر

 آب مقطر

 4 ـ 4 ـ 2 ـ طرز تهيه :

 تركيبات فوق را در آب مقطر حل نموده و ( در صورت لزوم حرارت دهيد ) PH را به گونه‏اي تنظيم كنيد كه پس از سترون كردن معادل 7/3 در دماي 20 درجه سلسيوس باشد . و سپس محيط را در به حجم‏هاي 5 تا 10 ميلي ليتر در لوله‏هايي به ابعاد 160*16 ميلي متر تقسيم كرده و به مدت 15 دقيقه در دماي 121 درجه سلسيوس سترون كنيد .

 4 ـ 5 ـ معرف اندول ( معرف كواكس )

 4 ـ 5 ـ 1 ـ تركيبات :

 Dimethylamino benzaldehyde

 5 گرم

 پارادي متيل آمينو بنزآلدهيد  

 ol or pentan-1-ol Methylbutan-1-

 75 ميلي ليتر

 2 ـ متيل 1 ـ بوتانل يا 1 ـ پنتانول

 Hydrochloric acid

  25 ميلي ليتر 

 اسيد كلريدريك ( با چگالي 1/19 تا 1/18 گرم بر ميلي ليتر در دماي 20 درجه سانتيگراد )

 4 ـ 5 ـ 2 ـ طرز تهيه :

 پارادي متيل آمينو بنزآلدهيد را در الكل (2 ـ متيل 1 ـ بوتانول ) و در بن ماري (5-5) با حرارت 50 الي 55 درجه سلسيوس حل كنيد . پس از حل شدن در حرارت محيط قرار دهيد تا خنك شود و سپس اسيد كلريدريك را به آن بيافزائيد و آن را در شيشه‏هاي تيره و دور از نور , در دماي تقريبي 4 درجه سلسيوس نگهداري كنيد . رنگ معرف زرد روشن تا قهوه‏اي روشن خواهد بود .

  5 ـ وسايل لازم

 يادآوري - جهت آگاهي بيشتر در رابطه با لوازم و دستگاهها و روش آماده سازي و سترون كردن آنها به استاندارد ملي ايران 2747 آئين كار در آزمايشگاه ميكروبيولوژي مواد غذايي مراجعه كنيد . وسايل شيشه‏اي بايد در برابر سترون سازي مكرر مقاوم باشند .

 - لوازم متداول آزمايشگاهي , به ويژه موارد زير ,

 5 ـ 1 ـ اتوكلاو ( وسيله سترون سازي مرطوب ) قابل تنظيم در دماي 121 درجه سلسيوس .

 5 ـ 2 ـ لوله‏هاي آزمايش با ابعاد تقريبي 160*16 ميلي متر و 200*20 ميلي متر و يا شيشه‏هاي مك كارتني يا يونيور سال با ظرفيت‏هاي مناسب .

 5 ـ 3 ـ لوله‏هاي دورهام , به اندازه مناسب جهت استفاده در لوله‏هاي آزمايش مطابق بند (5-.2)

 5 ـ 4 ـ حمام آب , قابل تنظيم در دماي بين 44±0/5 درجه سلسيوس

 5 ـ 5 ـ حمام آب , قابل تنظيم در دماي بين 50 و 55 درجه سلسيوس

 5 ـ 6 ـ گرمخانه , قابل تنظيم در دماي 37±1 درجه سلسيوس .

 5 ـ 7 ـ حلقه كشت از جنس پلاتين - ايريديوم يا نيكل - كروم و يا پلاستيكي يك بار مصرف سترون , به قطر تقريبي 3 ميلي متر .

 5 ـ 8 ـ PH متر , با دقت ±/01 واحد در دماي 25 درجه سلسيوس .

 5 ـ 9 ـ پي‏پت‏هاي مدرج با ظرفيت اسمي 10 و 1 ميلي ليتر .

  6 ـ نمونه‏برداري

 - نمونه‏اي كه به آزمايشگاه ارسال مي‏شود بايد نماينده واقعي كل محصول باشد و در طول حمل و نقل و انبارداري نبايد دچار تغيير و يا صدمه شده باشد .

 - نمونه‏برداري بايد طبق استاندارد ملي ايران 326 روش‏هاي نمونه‏برداري شير و فرآورده‏هاي آن تجديدنظر انجام شود .

  7 ـ طرز تهيه آزمايه

 7 ـ 1 ـ كليات :

 در اكثر موارد مي‏توان نمونه آزمايشگاهي را بدون هيچ آماده‏سازي بعدي به عنوان آزمايه استفاده كرد اگر لازم است مي‏توان دو يا چند نمونه آزمايشگاهي را مخلوط كرد تا آزمايه تشكيل شود . براي اين كار بايد نمونه‏هاي آزمايشگاهي را به يك ظرف سترون و با گنجايش كافي منتقل و خوب مخلوط كرد . قبل از باز كردن هر ظرف نمونه بايد محيط بيرون ظرف را در قسمت‏هايي كه نمونه برداشته مي‏شود كاملا تميز كرد و سپس به محلول اتانول 70 درصد حجم به حجم آغشته نمود . ( بدون سوزاندن ) فاصله زماني بين تكان دادن يا مخلوط كردن نمونه و برداشت آزمايه يا آزمونه نبايد از 3 دقيقه تجاوز كند . بايد دقت كرد آزمايه يا آزمونه در هنگام برداشت حالت كف آلودگي نداشته باشد .

 7 ـ 2 ـ مايعات

 7 ـ 2 ـ 1 ـ اگر در بالاي ظرف محتوي نمونه فضاي خالي كافي وجود دارد , نمونه‏هاي آزمايشگاهي مايع را با حجم بالاي 300 ميلي ليتر به طور دستي يا با شيكر به صورت عمودي به تعداد 25 بار در ثانيه مخلوط نماييد .

 7 ـ 2 ـ 2 ـ اگر فضاي خالي براي اطمينان از اختلاط كامل وجود ندارد , بايد نمونه آزمايشگاهي را با واژگون كردن ظروف حداقل 25 بار مخلوط نماييد و سپس

 الف - بخشي از مايع را به ظروف ديگري منتقل كنيد تا فضاي خالي كافي ايجاد شود و بعد براساس ( بند 7-2-1) با تكان دادن مخلوط كنيد يا

 ب - تمام يا بخشي از نمونه را به يك ظرف سترون با حجم مناسب منتقل كنيد و بعد با تكان دادن مخلوط كنيد (7-2-1)

 7 ـ 2 ـ 3 ـ نمونه‏هاي آزمايشگاهي به حجم 200 ميلي ليتر يا كمتر به عنوان آزمايه قابل استفاده‏اند .

 7 ـ 3 ـ كره و پنيرهاي سخت

 نمونه‏ها بايد هم از بسته‏بندي عمده و هم از بسته‏بندي‏هاي كوچك به كمك يك سوند سترون برداشت شوند . قطعات نمونه را در شرايط آسپتيك با كمك قاشقك يا قاشق سترون به يك ظرف سترون منتقل كنيد .

 7 ـ 4 ـ شيرخشك و ساير محصولات پودري

 مراحل عمومي مذكور در ( بندهاي 7-1 و 7-2) بايد پيروي شوند . نمونه‏هاي آزمايشگاهي با حجم 200 گرم يا كمتر مي‏توانند به عنوان آزمايه به كار روند .

 7 ـ 5 ـ محصولات نيمه جامد ( پنيرهاي نرم , ماست و دسرها )

 محتوي بسته‏بندي عمده يا بسته‏بندي كوچك بايد با قاشقك سترون مخلوط و سپس نمونه در شرايط آسپتيك به يك ظرف سترون با گنجايش مناسب منتقل شود .

  8 ـ روش كار

 8 ـ 1 ـ آزمونه و رقت‏هاي لازم

 آزمونه و ساير رقت‏ها را طبق استاندارد ملي ايران 356 روش آماده كردن نمونه‏هاي مواد غذايي و شمارش ميكروارگانيزم‏هاي مختلف تهيه كنيد .

 يادآوري - تعداد كافي از رقت‏ها تهيه كنيد تا مطمئن شويد كه تمام لوله‏هاي رقت نهايي نتيجه منفي مي‏دهد .

 8 ـ 2 ـ غني كردن در محيط انتخابي :

 8 ـ 2 ـ 1 ـ كشت :

 8 ـ 2 ـ 1 ـ 1 ـ سه لوله آزمايش بزرگ حاوي 10 ميلي ليتر محيط كشت غني كننده ( بند 4-3-1-1 ـ الف ) با غلظت دو برابر را انتخاب نموده به هر يك به وسيله پي‏پت سترون 10 ميلي ليتر از نمونه مورد آزمايش چنانچه مايع باشد و يا 10 ميلي ليتر از سوسپانسيون اوليه را در مورد ساير نمونه‏ها اضافه كنيد .

 8 ـ 2 ـ 1 ـ 2 ـ سه لوله كوچك ديگر حاوي 10 ميلي ليتر محيط كشت غني كننده ( بند 4-3-1-1 ـ ب ) با غلظت معمولي را انتخاب كرده و به هر كدام از آنها توسط پي‏پت سترون 1 ميلي ليتر از نمونه مورد آزمايش چنانچه مايع باشد و يا 1 ميلي ليتر از سوسپانسيون اوليه در مورد ساير نمونه‏ها اضافه كنيد .

 8 ـ 2 ـ 1 ـ 3 ـ براي تهيه رقتهاي دهدهي مطابق بند (8-2-1-2) هر بار از يك پي‏پت سترون جديد استفاده كنيد .

 8 ـ 2 ـ 1 ـ 4 ـ به كمك يك مخلوط كن 9 مناسب ماده كشت داده شده را با محيط كاملا مخلوط كنيد . دقت كنيد در حين مخلوط كردن هوا وارد لوله‏هاي دورهام نشود .

 8 ـ 2 ـ 2 ـ گرمخانه‏گذاري :

 لوله‏هاي آزمايش را ( از مرحله 8-2-1-1 تا 8-2-1-3) به مدت 24±2 ساعت در گرمخانه 37 درجه سلسيوس قرار دهيد . پس از اين مدت در صورت عدم مشاهده گاز لوله‏ها را 24 ساعت ديگر هم گرمخانه‏گذاري كنيد .

 8 ـ 3 ـ بررسي در دومين محيط انتخابي :

 8 ـ 3 ـ 1 ـ كشت :

 از لوله‏هاي گرمخانه‏گذاري شده حاوي گاز ( طبق بند 8-2-2) به وسيله حلقه كشت (5-7) در دومين محيط انتخابي (4-3-2) كه قبلا در حمام آب (4-5) تا 44 درجه سلسيوس گرم شده است كشت دهيد . سپس ماده كشت داده شده در محيط را مخلوط كنيد . دقت كنيد در حين مخلوط كردن هوا وارد لوله‏هاي دورهام نشود .

 8 ـ 3 ـ 2 ـ گرمخانه‏گذاري :

 لوله‏هاي كشت داده شده در مرحله 8-3-1 را در حمام آب ( بند 5-4) به مدت 24±2 ساعت در دماي 44 درجه سلسيوس گرمخانه‏گذاري كنيد . اگر در اين مرحله گاز مشاهده نشد , گرمخانه‏گذاري را تا 48±2 ساعت ادامه دهيد .

 8 ـ 4 ـ بررسي در آب تريپتونه :

 8 ـ 4 ـ 1 ـ كشت :

 از لوله‏هاي گرمخانه‏گذاري شده ( بند 8-3-2) كه تشكيل گاز داده‏اند با حلقه كشت (5-7) در آب تريپتونه‏اي كه قبلا در حمام آب با دماي 44 درجه سلسيوس قرار گرفته است كشت داده و مخلوط كنيد . دقت كنيد در حين مخلوط كردن هوا وارد لوله‏هاي دورهام نشود .

 8 ـ 4 ـ 2 ـ گرمخانه‏گذاري :

 لوله‏هاي كشت داده شده ( بند 8-4-1) را در حمام آب ( بند 5-4) و در دماي 44 درجه سلسيوس به مدت 48±2 ساعت گرمخانه‏گذاري كنيد .

 8 ـ 4 ـ 3 ـ آزمايش توليد اندول :

 0/5 ميلي ليتر معرف اندول (4-5) را به لوله‏هاي حاوي آب تريپتونه گرمخانه‏گذاري شده , بيافزائيد , به خوبي مخلوط كرده و بعد از يك دقيقه بررسي كنيد .

 ظهور رنگ قرمز در فاز الكلي نشانگر وجود اندول است ( لوله‏هاي مثبت )

 8 ـ 5 ـ تفسير :

 لوله‏هايي كه مطابق ( بندهاي 8-2-1-1 تا 8-2-1-3) كشت داده شده و مطابق بند (8-3-2) تشكيل گاز داده‏اند و مطابق ( بند 8-4-3) اندول مثبت مي‏باشند . از نظر وجود اشريشياكلي احتمالي مثبت هستند .

 براي هر رقت , تعداد لوله‏هاي مثبت را شمارش كنيد .

  9 ـ انتخاب رقتها :

 ياداوري - سوسپانسيون اوليه و آزمايه به عنوان رقت پايه در نظر گرفته مي‏شوند .

 9 ـ 1 ـ براي آزمايش هر نمونه , سه رقت متوالي را مطابق بندهاي (9-2,9-3,9-4) براي بدست آوردن شاخص MPN انتخاب كنيد .

 9 ـ 2 ـ در مواردي كه تنها سه رقت تهيه شده است آن سه رقت را براي بدست آوردن شاخص MPN به كار ببريد .

 9 ـ 3 ـ در مواردي كه بيش از سه رقت تهيه شده است , انتخاب تركيبات 3 تايي از آنها درجات احتمالي مختلف را نشان مي‏دهد , كه بصورت رده‏بندي مندرج در جدول 2 ( پيوست الف ) مشخص شده است و توضيحات مربوط به اين رده‏بنديها در جدول شماره 3 ( پيوست ب ) آمده است .

 9 ـ 4 ـ براي به دست آوردن شاخص MPN از تركيب سه رقت متوالي با خصوصيات رده 1 مندرج در جدول شماره 3 استفاده كنيد . اگر بيش از يك تركيب با خصوصيات رده 1 به دست آيد آن تركيبي را كه بيشترين تعداد لوله‏هاي مثبت را دارد استفاده كنيد .

 - اگر هيچ تركيبي با خصوصيات رده 1 بدست نيايد , تركيبي با خصوصيات رده 2 را استفاده كنيد . اگر بيش از يك تركيب با خصوصيات رده 2 بدست آيد از تركيبي كه بيشترين تعداد لوله‏هاي مثبت را دارد استفاده كنيد . ( براي مثال به جدول 1 مراجعه كنيد )

 - اگر هيچ تركيبي با خصوصيات رده 2 بدست نيايد , تركيبي با خصوصيات رده 3 را استفاده كنيد . اگر بيش از يك تركيب با خصوصيات رده 3 بدست آيد از آن تركيبي كه بيشترين تعداد لوله‏هاي مثبت را دارد استفاده كنيد . ( براي مثال به جدول 1 مراجعه كنيد )

 جدول 1 ـ مثالهايي از انتخاب نتايج مثبت براي محاسبه شاخص MPN

  10 ـ تعيين , محاسبه و بيان نتايج

 10 ـ 1 ـ تعيين شاخص MPN:

 شاخص MPN اشريشياكلي احتمالي را از تعداد لوله‏هاي مثبت (8-5) از هر رقت انتخابي ( بند 9) و با استفاده از جدول شماره 2 ( پيوست الف ) تعيين كنيد .

 10 ـ 2 ـ محاسبه بيشترين تعداد احتمالي (MPN:)

 بيشترين تعداد احتمالي اشريشياكلي در گرم يا در ميلي ليتر از فرآورده با ضرب كردن شاخص MPN (1-10) در عكس ضرب كمترين رقت انتخابي ( كه داراي بيشترين ميزان نمونه باشد ) به دست مي‏آيد .

 هنگامي كه كمترين رقت انتخابي با لوله‏هاي آماده شده با محيط غلظت 2 برابر ( كشت 10 ميلي ليتر آزمايه ) مطابقت داشته باشد شاخص MPN را بر 10 تقسيم كنيد .

 يادآوري 1 ـ در مورد فرآورده‏هاي مايع وقتي كه 10 ميلي ليتر از آزمايه به لوله‏هايي با غلظت 2 برابر منتقل مي‏شود شاخص MPN بر 10 تقسيم مي‏گردد و در مورد فرآورده‏هاي ديگر 10 ميلي ليتر از سوسپانسيون اوليه كه شامل 1 گرم از آزمايه باشد , منتقل مي‏شود .

 يادآوري 2 ـ چنانچه عدد به دست آمده در جدول MPN موجود نباشد , در اين صورت بيشترين تعداد احتمالي را با استفاده از فرمول توماس 10 به طريق زير مي‏توان محاسبه نمود .

يادآوري - طبق فرمول فوق , بيشترين تعداد احتمالي در 100 ميلي ليتر ( چنانچه نمونه مايع باشد ) و در 10 گرم ( در مورد ساير نمونه‏ها ) محاسبه مي‏گردد .

 10 ـ 3 ـ بيان نتايج :

 بيشترين تعداد احتمالي اشريشياكلي را در ميلي ليتر ( نمونه‏هاي مايع ) و يا در گرم ( ساير نمونه‏ها ) به صورت عددي بين 1 و 9/9 ضرب در توان مناسبي از 10 گزارش كنيد .

 اگر بيشترين تعداد احتماي اشريشياكلي كمتر از 0/3 در ميلي ليتر يا در گرم باشد . نتيجه را به صورت زير بيان كنيد . فاقد اشريشياكلي در 1 ميلي ليتر يا در 1 گرم از فرآورده .

11-دقت

به كارر گيري روش MPN ممكن است نتايج متفاوتي را ارائه دهد لذا نتايج حاصل از اين روش بايد با دقت واحتياط به كار برده شوند . حدود اطمينان در جدول شماره 2 ((پيوست الف )) نشان داده شده است .

12- گزارش آزمون

گزارش آزمون بايد شامل موارد زير باشد :

- روش نمونه برداري

- روش آزمون مورد استفاده

- نتايج به دست آمده از آزمون طبق اين استاندارد .

- كليه شرايط عملي ناگفته در اين استاندارد يا مواردي كه به طور اختياري برگزيده شده است و هم چنين كليه پيشامدهاي مؤثر در نتايج .

- كليه اطلاعات مورد نياز براي شناسايي كامل نمونه .

- شماره استاندارد ملي ايران

- تاريخ انجام آزمايش .

پيوست الف

 

  (( پيوست ب ))

 (( الزامي ))

 

 

 

 

 

1- Escherichia Coli

2- Most probable Number

3- Edible Ices

4- Test Sample

5- Speci menTest Portion

6- Index

7- salt Diluent/Peptone

8- Lauryl Suifate Tryptose Broth

9- Mixer

10-Thomas formuia


 

ISLAMIC REPUBLIC OF IRAN

 

Institute of Standards and Industrial Research of Iran

 

ISIRI NUMBER

 

5234

 

 

Milk and milk products – Enumeration of presumptive escherichia coli – most probable number technique